聚合酶链式反应技术（PCR）

聚合酶链式反应是快速扩增DNA序列最常用的方法。
PCR反应的模板DNA若是基因组上的某个片段，就称为genomic PCR，若是mRNA反转录产生的cDNA，就称为RT-PCR。

PCR技术原理

在合适的缓冲体系下，将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸，在一对引物的引导下合成新生的DNA互补链。

PCR基本要素

PCR反应体系：模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶、Mg2+、反应缓冲液
模板（template）：待拷贝的DNA称为模板，dsDNA or ssDNA，最后扩增得到的产物是双链状态的。
引物（primer）：DNA复制的先锋，就像结晶过程中的晶核，引导DNA的合成。在PCR扩增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。
底物（substrates）：dNTP
DNA聚合酶：Taq DNA polymerase，DNA复制的动力，在dNTP等底物存在时在引物的引导下沿着模板DNA合成互补的DNA链

•理想的PCR反应：
• X=$X_0*2^n$
•非理想的PCR反应：
• X=$X_0(1+Ex)^n$
• n：扩增反应的循环次数
• X：第n次循环后的产物量
• $X_0$：初始模板量
• Ex：扩增效率
Ex不接近100%的原因分析
小于100%：降解、污染、产物过长、检测荧光结合不足、底物加入太多抑制结合等
大于100%：引物错配

实时定量PCR（real time quantitative PCR，Q-PCR）

实时定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”,最后通过标准曲线对样品中的目的DNA (或cDNA) 的起始浓度进行定量的方法。

DNA产物的荧光标记

非特异性荧光标记：SYBR GreenⅠ
特异性荧光标记：TaqMan探针

非特异性荧光标记-SYBR GreenⅠ

工作原理
① SYBR GreenI能结合到双链DNA的小沟部位
② SYBR GreenI只有和双链DNA结合后才发荧光
③ 变性时，DNA双链分开，无荧光
④ 复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR GreenI发荧光，在此阶段采集荧光信号。

SYBR GreenⅠ作探针的实时定量PCR实验过程

特异性荧光标记-TaqMan探针

工作原理
TaqMan探针是一段与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA（50-150bp），该DNA的5’和3’端带有短波长和长波长两个不同荧光基团，由于彼此距离靠近，在荧光共振能量转移（FRET）作用下发生荧光淬灭，因而检测不到荧光。

实验过程

PCR扩增曲线

横坐标：扩增循环数（Cycle number）；纵坐标：荧光强度（Delta Rn）

结果分析时的几个基本概念

基线（Baseline）

基线（Baseline）：扩增曲线中的水平部分
调整原则：如果Ct值>18，不需调整，使用自动分析结果；
如果Ct值<18，修改终点，再分析一次；
起点一般取3~~6，终点一般取12~~15。

阈值线（Threshhold）

阈值线（Threshhold）：荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 10-15 个循环的荧光值。

Ct值（Cycle threshold）

Ct值定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。

模板DNA量越多，荧光达到阈值的循环数越少，即Ct值越小；
Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系
核酸检测与CT值

Ct值越小，代表样本中病毒含量越多，传染性越强；Ct值越大，代表样本中病毒含量越少，传染性越弱。

Ct值的应用

（1）绝对定量
确定未知样品的Ct值，通过标准曲线由位置样品的Ct值推算出其初始量。

Ct值是产物荧光强度首次超过设定阈值时，PCR反应所需的循环数。利用标准曲线，可以确定样品中待检测靶DNA的绝对含量。
（2）相对定量：通过内标定量
• 内标通常是β-actin等看家基因
• 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小
• 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量
相对定量分析法：-ΔΔCt法
前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏差在 5％以内
1、用内参基因的CT值确定目标基因的CT值：
ΔCT (test)= CT (target,test) – CT (ref,test)
ΔCT(calibrator)= CT (target, calibrator) – CT(ref, calibrator)
2、用校准样本的ΔCT值确定试验样本的ΔCT值：
ΔΔCT= ΔCT（test） - ΔCT（calibrator）
3、计算表达水平比率：
$(1+E) ^(–ΔΔCT)$=表达量的比值