分子生物学1-DNA复制
近期想重新复习一下分子生物学，以朱玉贤老师的《现代分子生物学》为参考。
第一章 绪论
分子生物学主要研究内容
从分子水平研究核酸的结构和功能从而阐明生命现象本质的科学，主要指遗传信息的传递（复制）、保持（损伤和修复）、基因的表达（转录和翻译）与调控。
分子生物学的缩影及大纲
遗传信息传递的中心法则
top-25-science-questions：
https://studylib.net/doc/7337970/top-25-science-questions
第二章 DNA和染色体结构
什么是基因？
（1）基因是产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。
（2）基因是DNA上的一段编码某种多肽链或RNA的序列，还包括不被转录和不被翻译的具有调节功能的序列。编码多肽链和RNA的基因称为结构基因。
DNA的化学本质
DNA化学组成
脱氧核糖核苷酸 (deoxyribonucleotide):
DNA或RNA都是由许许多多个核苷酸通过3’,5’-磷酸二酯键连接而成的生物大分子，而每个核苷酸又由磷酸、核糖和碱基三部分组成。
真核生物染色体DNA特点
真核细胞基因组的最大特点是它含有大量的重复序列，而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能DNA所隔开。
真核细胞DNA序列可被分为3类：
不重复序列（在单倍体基因组里，这些序列一般只有一个或几个拷贝；结构基因基本属于不重复序列）、中度重复序列（rRNA、tRNA以及某些结构基因如组蛋白基因等）、高度重复序列（卫星DNA，在DNA上串列重复高达数百万次）
基因组
基因组是指一套染色体中的完整的DNA序列。
- 基因组可以特指整套核DNA，也可以用于包含自己DNA序列的细胞器基因组，如粒线体基因组或叶绿体基因组。
- 基因组的大小：单倍体染色体中所有DNA的长度
- 基因的数量：一个基因组所包含的基因的的数量
- 基因的密度：每Mb基因组DNA中所包含的平均基因的数量
C值：通常是指一种生物单倍体基因组DNA的总量。
C值反常现象（C-value paradox）：C值往往与种系进化的复杂程度不一致，某些低等生物却具有较大的C值。
真核生物基因组结构特点
① 真核基因组庞大，一般都远大于原核生物的基因组。
② 真核基因组存在大量的重复序列。
③ 真核基因组的大部分为非编码序列(>90％)，是真核生物与细菌和病毒之间最主要的区别。
④ 真核基因组的转录产物为单顺反子。
⑤ 真核基因是断裂基因，有内含子结构。
⑥ 真核基因组存在大量的顺式作用元件(启动子、增强子、沉默子)。
⑦ 真核基因组中存在大量的DNA多态性：单核苷酸多态性和串连重复序列多态性。
⑧ 真核基因组具有端粒(telomere)结构。保护线性DNA的完整复制、保护染色体末端和决定细胞的寿命等功能。
原核生物基因组特点
① 原核生物的基因组很小，大多只有一条染色体，且DNA含量少
如大肠杆菌DNA的相对分子质量仅为$4.6×10^6bp$，其完全伸展总长约为1.3mm，含4000多个基因。
② 原核生物基因主要是单拷贝基因，只有很少数基因〔如rRNA基因〕以多拷贝形式存在；
③ 整个染色体DNA几乎全部由功能基因与调控序列所组成；
④ 几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列呈线性对应状态。
原核细胞DNA特点：
- 结构简炼:
原核DNA分子的绝大部分是用来编码蛋白质的，只有很小一部分控制基因表达的序列不转录。这些不转录DNA序列通常是控制基因表达的序列。 - 存在转录单元：
原核生物DNA序列中功能相关的RNA和蛋白质基因，往往丛集在基因组的一个或几个特定部位，形成转录单元,并转录产生含多个mRNA的分子，称为多顺反子mRNA。 - 有重叠基因：
一些细菌和动物病毒存在重叠基因：同一段DNA能携带两种不同蛋白质的信息
人类基因组
蛋白质编码区占人类基因组约2-3%
其它98%的基因被转录成ncRNA
生物的复杂性不由编码蛋白质的数目决定，而是被隐藏在它们所输出的非编码RNA内。
ncRNA是人与其他生物的主要差别：
•人和黑猩猩的基因差别为1‰,来源于非编码RNA 。
•人和鼠的蛋白质编码基因99%是共同的。
•人个体间单倍体基因组的碱基差异300万个,其中1万个(0.3%)
出现在蛋白质编码基因中,绝大多数存在于非编码RNA。
ncRNA的功能
- 翻译：rRNAs and tRNAs
- mRNA 成熟：snRNA 识别剪接位点
- RNA 修饰： snoRNA 将尿苷（uridine）修饰变成假尿苷（pseudo-uridine）
- 调节基因的表达与翻译：miRNAs
- DNA复制：端粒酶RNA – 作为合成端粒重复序列的模板
DNA在真核细胞中的结构
质粒：在电场作用下，相同分子质量的超螺旋DNA迁移率>线性DNA迁移率>开环的DNA迁移率
染色体
染色体是遗传物质的主要载体
染色体容易在有丝分裂时被碱性染料（龙胆紫和醋酸洋红）染成深色，所以称为染色体。
真核细胞染色体组成：DNA、组蛋白和非组蛋白及部分RNA。
组蛋白：
- 与DNA组成染色质（chromatin）的最小单位核小体（nucleosome）。
- 有H1、H2A、H2B、H3及H4五种，是染色体的结构蛋白。
- H1最不保守，其它进化上极端保守。
- 无组织特异性。
- 肽链上氨基酸分布的不对称性：
碱性氨基酸分布在N端；疏水基团在C端 - 存在较普遍的修饰作用：
甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等
第三章 DNA的复制
DNA的半保留复制：每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的
复制叉：复制时，双链DNA要解开成两股链分别进行，复制起点呈叉子形式
复制子：DNA的复制是由固定的起始点开始的。一般把生物体的复制单位称为复制子。一个复制子只含一个复制起点。
- 细菌、病毒和线粒体的DNA分子都是作为单个复制子完成复制的；
- 真核生物基因组可以同时在多个复制起点上进行复制，也就是说它们的基因组包含有多个复制子。
DNA复制主要是从复制起点开始的双向等速复制，所有已知的DNA聚合酶的合成方向都是5’→3’。
复制叉以DNA分子上某一特定顺序为复制起始点，向两个方向等速生长前进，至复制终止点终止。
DNA复制相关酶
| 蛋白质（基因） | 通用名 | 功能 |
|---|---|---|
| DnaA(dnaA) | 解链酶 | 辨认起始点 |
| DnaB(dnaB) | 解链酶 | 解开DNA双链 |
| DnaC(dnaC) | 解链酶 | 运送和协同DnaB |
| DnaG(dnaG) | 引物酶 | 催化RNA引物生成 |
| SSB | 单链DNA结合蛋白 | 稳定已解开的单链 |
| 拓扑异构酶 | 拓扑异构酶 | 理顺DNA链 |
（1）解链酶(helicase)
- 解链酶(helicase)又称解螺旋酶或rep蛋白
- 结合于后随链上复制叉处，利用ATP供能，
作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。 - 每解开一对碱基，需消耗2分子ATP。
（2）单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB)
- 在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整性。
（3）DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase)
- 拓扑异构酶作用特点
既能水解、又能连接磷酸二酯键
克服解链过程中的打结、缠绕现象 - 分类及作用机制
拓扑异构酶Ⅰ：切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。
反应不需ATP。
拓扑异构酶Ⅱ：切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。
利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。（主要）
（4）引物酶(primerase)
- 依赖DNA的RNA聚合酶
- 可以催化游离NTP聚合。
- 催化RNA引物的生成。
引物（primer）：是由引物酶催化生成的短链RNA，它可为DNA聚合提供3’-OH末端
（5）DNA聚合酶(DNA polymerase)
DNA聚合酶共同特点
- 都以脱氧三磷酸核苷dNTP为底物
- 都需要Mg2+激活
- 聚合时都必须有模板链和具有3’-OH末端的引物链
- 链的延伸方向为5’到3’
（6）DNA连接酶
连接DNA链3’-OH末端和相邻DNA链5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。
功能：
- 在复制中起接合双链中单链切口/缺 刻（Nick）的作用。
- 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合切口作用。
短的不连续片段称为冈崎片段。在细菌中，它们的长度约为1000 nt。在真核生物中，它们的长度约为200 nt
DNA复制基本过程
复制的起始
DNA双螺旋的解旋：
- DNA解旋酶将双螺旋两条链分开
- SSB稳定单链DNA，抑制分子内碱基对的形成
- 拓扑异构酶在复制叉上作用，去除在复制叉前面累计的正超螺旋
- 复制的引发：引物酶合成RNA引物
复制的延伸
- DNA聚合酶Ⅲ 在引物3’-OH末端开始延伸
- DNA聚合酶Ⅰ 去除RNA引物并替换为DNA核苷酸
- DNA连接酶：通过生成3’5’-磷酸二酯键连接两条DNA
复制的终止
Ter-Tus终止复合物参与复制的终止
原核生物DNA复制
大肠杆菌DNA复制
大肠杆菌DNA聚合酶
| DNA聚合酶Ⅰ | DNA聚合酶Ⅱ | DNA聚合酶Ⅲ | DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ |
|---|---|---|---|
| ① 3’→5’外切酶活性；② 5’→3’核酸外切酶活性除去冈崎片段5’端RNA引物，同时利用活性5’→3’聚合酶活性去除切口 | 活性很低，只有聚合酶Ⅰ的5%，主要参与修复DNA，具有3’→5’核酸外切酶活性 | 大肠杆菌DNA复制中链延伸的主导聚合酶：① 聚合活性强，是Ⅰ的15倍，Ⅱ的300倍；②合成速度：5万nt/min；③ 以二聚体形式发挥生物活性；④ 3’→5’核酸外切酶活性 | 主要在SOS修复过程中发挥功能 |
θ复制过程：
滚环复制过程：属于特定环状DNA分子的复制方式，是噬菌体DNA在细菌中最通常的一种复制方式；
D-loops
真核生物DNA复制
复制特点
1、有多个复制起点，复制叉移动速度约50 bp/s
2、在全部完成复制之前，各个起始点上DNA的复制不能再开始
3、DNA的复制只在S期进行
4、复制子相对较小，为40-100 kb
原核生物、真核生物、病毒复制起始位点共有特征：
① 起始位点是包括多个短重复序列的独特DNA片段；
② 多聚体DNA结合蛋白专一性识别这些短的重复序列
③ 起始位点旁序列是AT丰富的，能使DNA螺旋解开。
复制的起始、延伸
真核生物DNA的复制子被称为自主复制序列ARS (autonomously replicating sequences)，包括数个复制起始必需的保守区。
真核生物DNA复制的起始需要起始点识别复合物（origin recognition complex, ORC）参与，ORC由6种蛋白质组成，结合ARS
复制的终止
1、冈崎片段、复制子之间的连接
2、端粒的合成
端粒
因为DNA聚合酶只能添加到现有DNA链的3’端，所以在去除RNA引物后DNA聚合酶/连接酶不能填充染色体末端的缺口。如果这个差距没有填补，每轮复制后染色体会变短。
- 真核生物在其染色体末端有连续重复非编码序列（端粒）（保护帽，细胞分裂限制在50次以内）。
- 端粒酶（Telomerase，由与端粒重复序列互补的RNA和蛋白质组成）与末端端粒重复序列结合并催化添加新的重复序列。
- 通过延长染色体来补偿。
- 端粒酶活性的缺失或突变导致染色体缩短和有限的细胞分裂。
端粒酶由蛋白质和RNA组成
端粒酶的作用：
第四章 基因组DNA序列的变异与修复
DNA复制的准确性和DNA损伤修复具有重要意义。
DNA复制过程中的变异与修复
大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ具有3’→5’核酸外切酶活性，因此具有校对功能。
在动物细胞中，δ和εDNA聚合酶具有校对活性。
DNA突变与修复
突变（mutation）：DNA碱基序列的永久性、可遗传的改变。
导致突变的原因有自发的和诱导的。
SNP（单核苷酸多态性）
SNP指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A,T,C,G）的突变而引起的多态性。
SNP是基因组中最简单最常见的多态性形式，具有很高的遗传稳定性。
一个SNP表示在基因组某个位点上一个核苷酸的变化:
- 转换(C←→T，在其互补链上则为G←→A)，占SNP总量的2/3
- 颠换（C←→A，G←→T，C←→G，A←→1）
根据SNP在基因组中的分布位置可分为三类
1.基因编码区SNP(cSNP)，20%
(1)同义cSNP(synonymous cSNP)
即SNP所导致的编码序列改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同;
(2)非同义cSNP(non-synonymous cSNP)
指碱基序列的改变可使以其为蓝本翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能。是导致生物性状改变的直接原因。
2.基因调控区SNP(pSNP)
影响基因表达量的多少
3.基因间随机非编码区SNP(rSNP)
